ICS 65.020.30 B45 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3316—2018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J (ALV-J) 2018 - 06 - 12 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 07 - 12 实施 发 布 DB37/T 3316—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：成子强。 I DB37/T 3316—2018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 1 范围 本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。 本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 禽白血病病毒J亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J . ALV-J ALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免 疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。 2.2 抗原/抗体检测 通过标准的酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测ALV-J的抗原/ 抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒，用血清检测ALV-J抗体，用棉拭子检测ALV-J群特 异性抗原（p27）具体实验步骤参照GB/T 26436。抗体及p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑ALV-J 感染。 2.3 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。 2.4 RT-PCR 反转录-聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）。 3 材料与试剂 3.1 3.2 常规使用的 ELISA 抗原/抗体检测试剂盒 (IDEXX)。 常规使用的商品化的 RNA 提取试剂盒。 3.3 常规使用的商品化的 RNA 反转录试剂盒。 3.4 各检测方法所需的试剂。 3.4.1 PBS 缓冲液见附录 A 中 A.1。 3.4.2 灭菌水。 1 DB37/T 3316—2018 3.4.3 蒸馏水。 3.4.4 细胞生长培养基见附录 A 中 A.2。 3.4.5 细胞维持培养基见附录 A 中 A.3。 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。 4 仪器与设备 4.1 全自动高温高压灭菌锅 (温度范围：105-134℃；额定压力：0.23Mpa)。 4.2 低速离心机。 4.3 4.4 PCR 仪。 二氧化碳恒温细胞培养箱。 4.5 液氮储存罐。 4.6 4.7 4.8 研磨器。 手术剪。 各量程移液枪。 4.9 超低温冰箱。 4.10 酶标仪。 4.11 分光光度计 5 抽样 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品的采集 按1 %的比例，随机选取疑似J亚群禽白血病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器 100 mg 分装于1 mL 储存管内，并及时冻存于-80 ℃冰箱或液氮罐内备用。 5.1.2 血液样品的采集 用2.5 mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1 mL左右的静脉血，放入编号离心管内，倾斜静置， 待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于-20 ℃冰箱备用。 5.1.3 泄殖腔棉拭子的采集 用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1 mL PBS缓冲液的离心管内，储存于-20 ℃冰箱 备用。 5.2 样品运输与存放 采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输 ，然后上述要求及时放入液氮罐或-80 ℃冰箱或 -20 ℃冰箱储存。 6 6.1 操作方法 方法 2 DB37/T 3316—2018 6.1.1 抗原/抗体检测 抗原/抗体检测是采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测。 6.1.1.1 样品处理 检测样品前，棉拭子应反复冻融2 次～3 次，4 ℃，1006.2×g （3000转）离心2 min～3 min，吸 取上清。血清样品于室温融化， 500 倍稀释，用于检测。 6.1.1.2 操作步骤 按照试剂盒提供的检测步骤操作。 6.1.1.3 结果判定 只要p27抗原和ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测。 6.1.2 RT-PCR 检测 通过对疑似病例组织RNA提取，反转录为cDNA作为模板进行特异性PCR检测。 6.1.2.1 RNA 及 cDNA 提取 将冻存于液氮罐内的组织用商品化试剂盒提取RNA，用分光光度计测浓度后用商品化试剂盒反转录 成cDNA。RNA储存于-80 ℃冰箱，cDNA储存于-20 ℃冰箱。 6.1.2.2 操作步骤 先完成RNA提取，具体操作按照试剂盒提供的步骤即可，测定浓度，然后将RNA反转录成cDNA，以cDNA 为模板，利用ALV-J gp85片段的特异性扩增进行PCR扩增，扩增产物于120 V电压，1 %琼脂糖凝胶电泳 检测。剩余的RNA保存于-80 ℃冰箱，cDNA保存于-20 ℃冰箱。具体反应条件见附录B。 6.1.2.3 结果判定 琼脂糖凝胶电泳中出现特异的545 bp的片段条带时，进行下一步检测。 6.1.3 6.1.3.1 病毒分离 DF-1 细胞传代培养 取生长状态良好的DF-1细胞传代并用生长培养基培养至少4 小时，待细胞密度达到60 %～70 %后用 于病毒分离。 6.1.3.2 组织研磨液制备 采用鸡肝脏/肾脏/脾与DMEM培养液充分混合、研磨后，作为病毒研磨液，并用超声波破碎90 循环， 每个循环工作时间3 秒、间隔时间2 秒，重复两次，1006.2×g离心3 min后，上清用0.22μ m的微孔滤 器过滤除菌。 6.1.3.3 病毒液感作 DF-1 细胞 在二氧化碳培养箱培养了至少4 h的DF-1细胞倒掉生长培养基，将1mL组织滤液注入培养瓶/培养板 内，作用于DF-1细胞，将细胞放在二氧化碳培养箱内作用1h后更换细胞维持培养基，培养至少7 天。 3 DB37/T 3316—2018 6.1.3.4 p27 抗原检测 采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测 6.1.3.5 结果判定 p27抗原阳性，可判定为ALV-J感染。 6.1.4 结果诊断 RT-PCR及病毒分离时DF-1细胞上清p27检测结果均为阳性时，可诊断为ALV-J感染。 4 DB37/T 3316—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 材料与试剂配制方法 A.1 PBS缓冲液 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.42 g（Na2HPO4 ·12H2O 3.58 g），KH204 0.27 g溶于蒸馏水，定 容于1000 mL，过滤后高压灭菌备用。 A.2 细胞生长培养基 达尔伯克必需基本培养基（Dulbecco's Minimum Essential Medium，DMEM）粉剂1 包，NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗10 mL，胎牛血清100 mL，溶于蒸馏水，定容为1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于4 ℃ 冰箱备用。 A.3 细胞维持培养基 达尔伯克必需基本培养基（Dulbecco's Minimum Essential Medium，DMEM）粉剂1包，NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗10 mL，胎牛血清10 mL，溶于蒸馏水，定容为1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于4 ℃ 冰箱备用。 5 DB37/T 3316—2018 BB 附 录 B （规范性附录） RT-PCR 引物信息 禽白血病病毒J亚群（ALV-J）RT-PCR检测所需引物序列。 引物浓度均为10 pmol。 引物名称 上游引物 下游引物 序列 长度 5’-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 扩增目的 用途 禽白血病病毒J亚群 扩 增 出 的gp-85 特异 （ALV-J）gp-85基因 性片段进行琼脂糖凝 ’ 5’-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 ’ 545bp 片段 胶电泳检测 6 DB37/T 3316—2018 CC 附 录 C （规范性附录） RT-PCR 反应条件 C.1 反转录体系为：采用 20 μ L体系，在PCR管中依次加入 5X Prime Script Master Mix 4 μ L,模板 RNA x μ L（x=1000/RNA浓度），用RNase Free dH2O补足 20 μ L。 C.2 C.3 反转录条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。 PCR反应体系为：反应总体系为 25 μ L，在PCR管中依次加入,2×Tap PCR MasterMix12.5 μ L，1 0 pmol/μ L的上下游引物各 0.5 μ L，模板cDNA1 μ L，其余用灭菌水补至 25 μ L。 C.4 循环条件：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，进行 30 个 循环，最后于 72 ℃延伸 10 min。4 ℃保存。反应后，PCR产物取 7μ L～8 μ L，在 2 %琼脂糖凝胶电泳 检测。 图C.1 PCR 扩增电泳结果（N 为阴性对照） _________________________________ 7