ICS 65.020.30 B 44 DB14 山 西 省 地 方 标 准 DB 14/T 1942—2019 实验动物 中国地鼠微卫星 DNA 检测方法 Laboratory animal Method for microsatellite markers of Chinese hamster 2019 - 12 - 01 发布 山西省市场监督管理局 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB14/T 1942—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 抽样 .............................................................................. 1 4 方法 .............................................................................. 2 I DB14/T 1942—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由山西省科学技术厅提出、归口并监督实施。 本标准起草单位：山西医科大学。 本标准主要起草人：宋国华、刘田福、陈朝阳、高继萍、张锐虎、续国强。 II DB14/T 1942—2019 实验动物 中国地鼠微卫星 DNA 检测方法 1 范围 本标准规定了实验动物 中国地鼠（以下简称实验中国地鼠）遗传检测抽样数量及微卫星 DNA 检 测方法。 本标准适用于实验中国地鼠品系鉴别、质量控制及遗传组成分析。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 实验中国地鼠 laboratory Chinese hamster 指经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、 教学、生产和检定以及其它科学实验的中国地鼠 (Gricetulus griseus)。 2.2 近交系中国地鼠 inbred strain Chinese hamster 以全同胞或亲子交配方式繁殖 20 代以上的中国地鼠，近交系数达 98.6%以上。 2.3 封闭群中国地鼠 closed colony Chinese hamster 以非近亲交配方式繁殖中国地鼠，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖 4 代以上。 2.4 微卫星 DNA microsatellite DNA 是指基因组中由 1～6 个碱基组成的串联重复序列。不同个体的重复数不同而形成了微卫星 DNA 的多态性。 3 抽样 对近交系中国地鼠抽样数量不做要求。每个封闭群随机抽取非同窝成年实验中国地鼠，雌雄各半。 采样数量按表1进行。 1 DB14/T 1942—2019 表1 4 封闭群实验中国地鼠遗传检测抽样要求 群体数量（只） 抽样数量（只） 少于 100 ≥15 大于 100 ≥30 方法 4.1 采样 观察动物外观，核对编号，中国地鼠取 0.5 cm 尾尖组织或眼眶静脉丛采血，-20℃低温保存。 4.2 微卫星位点的选择 各微卫星位点的名称、引物序列、等位基因数、PCR 反应的退火温度见表 2。PCR 引物的 5’端用 FAM 荧光染料进行标记。近交系中国地鼠在表 2 中选择 10 个微卫星位点，封闭群中国地鼠在表 2 中选 择 15 个微卫星位点。 表2 位点 中国地鼠微卫星位点 引物序列 退火温度 (°C) 片段大小 最大等位基因数 51 354-391 4 58 242-299 7 58 233-292 9 51 270-355 5 58 376-432 12 58 167-214 12 59 217-357 5 F: AGGCTGCTTCCTAAACCCAT Chm35 R: CTGGGAAGGCTGAACTCAAG F: TCTGTGTGTCTGTGAATGCG Chm93 R: GGATGTAAGATGGCTCCGAA F: CATCTGGGCTTTCAATGGAT Chm147 R: GCTCCCTAAATAACCCCCAA F: AGGGGAGATCTTGGGTCAGT Chm79 R: AACATGGAGGAGCACAAACC F: GATAGGAGGGAGCAAAAGGG Chm120 R: CCTGAGAGCCTCAGAGCAGT F: TCTTCCCTTCACAACCCAAG Chm162 R: AGCAGTGCCCTTTGAAACAT Chm10 2 F: GGCTGGTGATTTCAATGGTT DB14/T 1942—2019 R:GTTCTTAATGGATCTACCCTGGGACC F: CAATGGCTGCTAAGAGAGGG Chm108 59 392-471 5 59 171-220 6 59 355-404 4 59 383-428 5 59 259-316 4 60 168-205 7 60 369-448 10 59 326-367 6 59 118-145 5 59 104-145 7 R: GTTCTTTCCCACTCACAATTTTCCTTG F: TACTCCTGTCTCCACCTCCC Chm115 R: GTTCTTTCTGGGGGATGTATGCTCTC F: CAGATGCCCAAACTCTCTCC Chm124 R:GTTCTTGTCACCCCATGGACTACACC F: TGCCCACATACATGACACAA Chm134 R: GTTCTTTCCCAACACCCTCTTCTGAC F: GACCCCATTCGTAAACCAGA Chm14 R: GTTCTTCCCCACAGTCAGCCCTATATT F: GCAGCTGGTTTTGAGCTACC Chm140 R: GTTCTTTGTTTGATCACTGGAACCCA F:AAAGGCCTTGAGGTGGAGTT Chm48 R:GTTCTTGAGGTAGGCAGGGACTGACA F:AGTTTGATGATCCCCAGCAC Chm54 R: GTTCTTCTACCCCTCTCAGCAACCTG F:GACAGATCCCGACCCATTTA Chm9 R:GTTCTTGTCCTGAGCAAGTCCAGAGC F:GCAGAAGCACAAACCAACAA Chm91 R: GTTCTTAGGCCAAGCTCTTCTCTTCC 4.3 PCR 扩增 4.3.1 提取基因组 DNA 用苯酚氯仿法或试剂盒提取基因组 DNA。 4.3.2 PCR 扩增体系 PCR 扩增总体积为 10 μL，其中 DNA( 20 ng / μL) 0.8 μL，10 × Buffer 1.0 μL，Mg2 +( 25 mmol/L) 0.8 μL，d NTP( 2.5mmol / L) 0.8 μL，上、下游引物 ( 1 pmol / L) 各 0.1 μL，Taq DNA 聚合酶( 5 U /μL) 0.1 μL，dd H2O 6.3 μL。 PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 30 s，退火（退火温度见表 2）30 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环；72 ℃延伸 20 min。扩增产物 4℃保存。 3 DB14/T 1942—2019 4.3.3 PCR 产物的检测 PCR 产物，经 1.5％的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。 4.3.4 扩增产物的 STR 扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后， 选择以 FAM 蓝色荧光标记的扩增产物， 取 1 µL 上样进行 STR 扫描。 4.4 STR 扫描结果的判读与统计分析 4.4.1 STR 扫描结果的判读 扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波。 同时，根据软件读出波峰处的扩增产物的碱基对数。由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的 扩增片断大小。每个位点的等位基因根据扩增片断从小到大顺序排列纪录为 a，b，c，d 等。 4.4.2 运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析 将所有样本的每个微卫星位点的基因型以 ab，bb 等形式输入群体遗传分析软件的数据文件，计算 样品在各微卫星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数（Ne）、平均杂合度 （H）等。 4.5 结果判定 4.5.1 近交系中国地鼠 所有样品检测位点的等位基因都符合品系的特征，没有新的等位基因出现为合格的近交系中国地 鼠。否则判为不合格。 4.5.2 封闭群中国地鼠 群体内遗传变异采用平均杂合度指标或群体平衡状态方法进行评价。平均杂合度在 0.5～0.7 时，且 期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为合格的封闭群中国地鼠群体。 或者，首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率的实际值，然后可计算出基因频率和基因型频 率的预期值。用实际值和预期值比较，通过卡方检验，可知被监测群体是否达到平衡状态。如果没有达 到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群中国地鼠群体判为不合格。 _________________________________ 4