(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210097151.8 (22)申请日 2022.01.26 (71)申请人 江西新龙生物科技股份有限公司 地址 336000 江西省宜 春市袁州区医药工 业园 申请人 江西省科 学院应用化学研究所 (72)发明人 邓方坤　蔡德珍　危云云　 欧阳智刚 　王希　卢占军　胡珊玲　 刘新军　徐梅　占军平　 (74)专利代理 机构 北京天盾知识产权代理有限 公司 11421 专利代理师 张彩珍 (51)Int.Cl. G01N 21/78(2006.01) G01N 21/01(2006.01)G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试 剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于比色法快速检测柑 橘黄龙病的试剂盒， 包括溶解液、 淀粉显色液、 比 色卡和检测试纸； 其中， 检测试纸为砂纸， 比色卡 包括不同淀粉浓度对应的显色照片； 该试剂盒操 作简单且操作所需时间短， 滴入碘液后即时检测 出结果， 利于田间的即时取样检测， 具有快速高 效简便的特点， 而且比色的界限清晰， 判定准确， 显著提高检测准确率； 本发明公开了一种基于比 色法快速检测柑橘黄龙病的方法， 该方法简单、 易操作且检测准确率高。 权利要求书1页 说明书16页 附图2页 CN 114441520 A 2022.05.06 CN 114441520 A 1.一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的试剂 盒， 其特征在于， 包括溶解液、 淀粉显色 液、 比色卡和检测试纸； 其中， 所述检测试纸为砂纸， 所述比色卡包括不同淀粉浓度对应的 显色照片。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述溶解液包括醋酸钠 ‑醋酸缓冲溶液、 磷酸二氢钾 ‑磷酸氢二钾缓冲溶液、 磷酸二氢钠 ‑磷酸氢二钠缓冲溶液和乙醇水溶液中的一 种或多种。 3.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述淀粉显色液包括碘酒、 碘 ‑碘化钾溶 液和聚乙烯吡咯烷酮碘中的一种或多种。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述比色卡 通过以下 方法获得： 称取可溶性淀粉， 用溶解液搅拌溶解， 分别制成不同淀粉浓度的溶液， 向每个浓度的淀 粉溶液中滴加淀粉显色液进行显色， 拍照制成不同淀粉 浓度对应的显色照片。 5.根据权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述比色卡 通过以下 方法获得： 称取可溶性淀粉， 用溶解液搅拌溶解分别制成淀粉浓度 为0ppm～6000ppm的溶液， 向每 个浓度的淀粉 溶液中滴加淀粉显色液进行显色， 拍照， 制成淀粉浓度为0ppm～6000ppm对应 的显色照片。 6.一种基于比色法快速检测柑橘黄龙病的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 摘取若干片疑似黄龙病树的叶片， 使用同一片检测试纸的磨砂面在每片叶片上 摩擦， 使叶片的叶肉组织粘附于检测试纸上； 步骤2： 将粘附有叶肉组织的检测试纸置于溶解液中， 使得检测试纸上的叶肉组织分散 在溶解液中； 步骤3： 向含有叶肉组织的溶解液中滴加淀粉显色液， 使溶解液中的叶肉组织与淀粉显 色液混合显色； 步骤4： 将步骤3中溶解液的显色与比色卡中不同淀粉浓度对应的显色照片进行对比， 得到疑似黄龙病树叶片 中的淀粉浓度， 若叶片 中的淀粉浓度大于或等于淀粉判定边界值， 则判定为阳性； 若叶片中的淀粉 浓度小于 淀粉判定边界值， 则判定为阴性。 7.根据权利要求6所述的快速检测柑橘黄龙病的方法， 其特征在于， 所述步骤1中若干 片的叶片为1～5片。 8.根据权利要求6所述的快速检测柑橘黄龙病的方法， 其特征在于， 所述步骤1包括： 使 用同一片检测试纸的磨砂面在每片叶片的正 面或背面上摩擦10～ 20次。 9.根据权利要求6所述的快速检测柑橘黄龙病的方法， 其特征在于， 所述步骤4中淀粉 判定边界值 为3000ppm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114441520 A 2一种基于比色法 快速检测柑橘黄龙病的试剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明涉及柑橘黄龙病检测技术领域， 具体涉及 一种基于比色法快速检测柑橘黄 龙病的试剂盒和方法。 背景技术 [0002]在我国柑橘黄龙病主要是由柑橘韧皮杆菌的亚洲种(CandidatusLiberibacter   asiaticus)所导致， 黄龙病的传播包括嫁接、 柑橘 木虱传播以及带病(虫)柑橘苗木的私调 乱引增多， 黄龙病的传播导致该病有逐年扩大的趋势； 目前黄龙病仍然没有治愈的办法， 该 病极易传播， 而且树体感染病菌后在5年到10年死亡， 造成柑橘绝产； 目前只能通过砍树、 控 制木虱和改种其他品种果树来缓解黄龙病的扩散， 但是这些措施仍然 无法有效遏制黄龙病 的蔓延； 据 统计中国柑橘总量占世界柑橘总量的12％， 然而黄龙病发生对我国的柑橘产业 特造成了巨大 的威胁； 柑橘从种植到丰产要七八年左右， 而黄龙病的发生毁掉了果农近十 年的心血， 给农户造成了巨大的经济损失， 对于我国整个柑橘产业而言， 黄龙病始终是无法 绕开的核心课题。 [0003]黄龙病的快速检测特别是在能为广大农户广泛使用的便捷快速检测方法是整个 黄龙病防控的关键一环， 目前柑橘黄龙病的检测方法包括使用荧光定量P CR方法进 行检测、 基于单克隆抗体技术进行检测、 采用目测的方法来观察黄龙病的有无以及基于碘淀粉 反应 的诊断方法进行检测。 [0004]使用荧光定量PCR方法进行检测例如通过改进引物或者PCR方法进行黄龙病的检 测， 该方法需要从柑橘叶片叶柄处分离提取柑橘黄龙病病菌的DNA， 然后通过特异引物进 行 荧光定量PCR检测， 而且对样品的处理和柑橘黄龙病病菌DNA的提取需要一定的技术和经 验， 具有耗时长、 技术难度高且检测成本较高的缺陷， 而且平均一个样品的费用在150元 ‑ 200元左右， 极大限制了该方法的大规模田间应用； 基于单克隆抗体技术进 行检测包括制备 与黄龙病病菌的特异蛋白质结合而不与健康叶片发生结合的单克隆抗体， 对柑橘黄龙病进 行ELISA检测， 这种方法具有灵敏度高的特点， 但是单克隆抗体生产成本高， 而且通常需要 低温如‑20℃到‑80℃保藏， 4℃保藏其中抗体中含有的蛋白酶杂质会将抗体逐渐 分解， 这使 得该技术使用具有很大局限性； 采用目测的方法来观察黄龙病的有无是指农户通常通过叶 片是否斑驳， 有无黄梢等来判断是否有黄龙病， 由于叶片的斑驳和黄稍容易和其他柑橘病 症或者营养缺素混淆， 使该 方法对于早期发病的树无法做出准确的判断。 [0005]由于柑橘黄龙病病菌堵塞维管束， 并分泌毒性多肽干扰柑橘叶片正常的糖代谢， 使得黄龙病病叶中淀粉有异常积累， 基于碘淀粉反应的诊断方法进行检测来源于 Schneider(1968)发现黄龙病感染的叶片中淀粉含量很高， 目前基于碘淀粉反应的诊断方 法进行检测包括将叶片剪切成细条状， 并在 ‑4到‑15℃冷冻12 ‑24小时， 进行脱色处理(除去 叶绿素， 排除叶绿素的影响)， 在脱色后的叶片上直接滴加淀粉显色液， 用碘对叶片中淀粉 进行显色， 如果叶片不变色， 则为健康叶， 如果变蓝 色则为黄龙病叶， 从而 快速诊断黄龙病； 该方法操作时间长、 不方便， 不利于田间的即时检测使用； 而且该方法中忽略了淀粉是普遍说　明　书 1/16 页 3 CN 114441520 A 3