(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210934869.8 (22)申请日 2022.08.04 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100083 北京市海淀区清华 东路35号 (72)发明人 安新民　薛胤轩　陈婷婷　吴茹茜　 李影　齐婉芯　鲁海琳　郭斌　 (74)专利代理 机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 专利代理师 余光军 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测响叶杨基因组的PCR特异性引物以及 PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了检测响叶杨基因组的PCR特异 性引物以及PCR检测方法。 本发明基于银白杨、 新 疆杨、 响叶杨和山杨的基因组， 通过全基因组序 列比对分析发现基因组中具有较大差异的片段 并据此设计每种杨树特异引物， 最终筛选出能够 将响叶杨基因组与其它杨树基因组准确区分的 特异性引物。 本发明进一步提供了应用该特异性 引物建立快速区分响叶杨与其他杨属树种的PCR 检测方法以及PCR检测试剂盒。 本发明可以快速 区分响叶杨与其他杨属树种， 操作方便， 带型简 单， 不需要测序直接通过扩增片段即可区分出响 叶杨特异基因组片段， 在杨树种植资源分类、 利 用及杂交种的鉴定方面具有应用前 景。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 115058539 A 2022.09.16 CN 115058539 A 1.将响叶杨(Populus  adenopoda Maxim.)与其它杨属树种基因组相区分的特异性PCR 引物对， 其特征在于， 选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1的上游引物的核苷 酸序列为： CATGAAATTTTTAGCTGCGAGA， 所述引物对1的下游引物的核苷酸序列为： TGCATAGATC CAGTTAAGAGTTGA； 所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为： TAAAAGCAACGAGAGTGACACC， 所述引物对2的 下游引物的核苷酸序列为： C CATGCACCATAATATCAAACA。 2.根据权利要求1所述的特异性PCR引物对， 其特征在于， 所述的其它杨属树种包括银 白杨(Populus  alba L.)、 新疆杨(Populus  alba var.pyramidalis  Bge)和山杨(Populus   davidiana  Dode)。 3.权利要求1所述的特异性PCR引物对在检测响叶杨基因 组中的应用。 4.一种将响叶杨(Populus  adenopoda  Maxim.)与其他杨属树种相区分的PCR检测方 法， 其特征在于， 包括： (1)提取待检测的杨树样品DNA； (2)以提取的杨树样品DNA为模板， 以权利要求1的引物对1或引物对2的上游引物和下 游引物为PCR扩增引物对建立PCR反应体系进行PCR扩增； 如果出现了特异性扩增条带， 则表 明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因 组成分； 所述的其它杨属树种包括银白杨(Populus  alba L.)、 新疆杨(Populus  alba  var.pyramidal is Bge.)、 山杨(Populus  davidiana  Dode)。 5.根据权利要求4所述的PCR检测方法， 其特征在于， 以权利要求1的引物对1的上游引 物和下游引物 为PCR扩增引物建立P CR反应体系进 行PCR扩增， 如果出现了500bp的特异性扩 增条带， 则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因组成分； 以权利要求1的引物对2的上 游引物和下游引物 为PCR扩增引物对建立PCR反应体系进行PCR扩增， 如果出现了594bp的特 异性扩增条 带， 则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因 组成分。 6.根据权利要求4所述的PCR检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所建立的PCR反应体系 包括： 待检测的样品DNA  2 μL， PCR Mix 10 μL， 上游引物0.5 μL， 下游引物0.5 μL， 双蒸水 7 μL。 7.根据权利要求4所述的PCR检测方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的PCR扩增的程序 包括： 95℃5mi n， 95℃30s， 退火3 0s， 72℃3 0s， 35个循环， 72℃5mi n， 12℃,∞。 8.根据权利要求4所述的PCR检测方法， 其特征在于， 所述的其它杨属树种包括银白杨 (Populus  alba L.)、 新疆杨(Populus  alba var.pyramidalis  Bge.)、 山杨(Populus   davidiana  Dode)。 9.一种检测响叶杨基因组的PCR检测试剂盒， 包括： Taq酶， dNTP， Mg2+， ddH2O和PCR扩增 引物对； 其特征在于， 所述P CR扩增引物对选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1 的上游引物的核苷酸序列为： CATGAAATTTTTAGCTGCGAGA， 所述引物对1的下游引物的核苷酸 序列为： TGCATAGATC CAGTTAAGAGTTGA； 所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为： TAAAAGCAACGAGAGTGACACC， 所述引物对2的 下游引物的核苷酸序列为： C CATGCACCATAATATCAAACA。 10.权利要求9所述的PCR检测试剂盒在检测响叶杨基因 组中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115058539 A 2检测响叶杨基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及检测杨树种类的引物以及检测方法， 尤其涉及检测响叶杨(Populus   adenopoda  Maxim.)基因组的PCR特异性引物以及PCR检测方法， 属于响叶杨基因组的PCR检 测领域。 背景技术 [0002]目前针对不同树种鉴定的引物主要以SSR为主， 但SSR引物存在于所有物种中， 基 因组水平不够特异， 迄今为止， 缺少仅针对响叶杨的基因组特异的鉴定引物， 这种特异引物 可以快速鉴定出某一树种中是否有响叶杨的基因组成分， 从而可以推断响叶杨是否参与了 该树种的形成。 发明内容 [0003]本发明的目的之一是提供准确鉴别响叶杨基因 组的特异性PCR引物对； [0004]本发明的目的之二是提供一种快速区分响叶杨与其 他杨属树种的PCR检测方法； [0005]本发明的目的之三是提供一种检测响叶杨基因 组的PCR检测试剂盒。 [0006]本发明的上述目的是通过以下技 术方案来实现的： [0007]本发明的一方面是提供了将响叶杨与其它其他杨属树种基因组相区分的特异性 PCR引物对， 选自引物对1或引物2中的任何一对； 所述引物对1的上游引物的核苷 酸序列为： CATGAAATTTTTAGCTGCGAGA ， 所述 引物对1的下游引物的 核苷酸序列为 ： TGCATAGATC CAGTTAAGAGTTGA； [0008]所述引物对2的上游引物的核苷酸序列为： TAAAAGCAAC GAGAGTGACACC， 所述引物对 2的下游引物的核苷酸序列为： C CATGCACCATAATATCAAACA。 [0009]本发明的第二方面是提供了一种区分响叶杨与其他杨属树种的PCR检测方法， 包 括： [0010](1)提取待检测的杨树样品DNA； [0011](2)以提取的杨树样品D NA为模板， 以引物对1或引物对2的上游引物和下游引物为 PCR扩增引物对建立PCR反应 体系进行PCR扩增； [0012](3)如果出现了特异性的扩增条带， 则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因 组成分； 其中， 以引物对1的上游引物和下游引物为PCR扩增引物建立PCR反应体系进行PCR 扩增， 如果出现了500b p的特异性扩增条带， 则表明待检测的杨 树样品中含有响叶杨基因组 成分； 以引物对2的上游引物和下游引物为PCR扩增引物对建立PCR反应体系进行PCR扩增， 如果出现了 594bp的特异性扩增条 带， 则表明待检测的杨树样品中含有响叶杨基因 组成分。 [0013]作为本发明的一种优选的具体实施方案， 步骤(2)中所建立 的PCR反应体系包括： 待检测的样品DNA  2 μL， PCR Mix 10 μL， SEQ  ID No.3所示的上游引物0.5 μL， SEQ  ID No.4所 示的下游引物0.5 μL， 双蒸水 7 μL。 [0014]作为本发明的一种优选的具体实施方案， 步骤(2)中所述 的PCR扩增的程序包括：说　明　书 1/3 页 3 CN 115058539 A 3