(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211022050.0 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 武汉友芝友医疗科技股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速器1.2期23栋1单元4、 5层 (72)发明人 祝丹平　魏亮　董祥　王灿　 吴文雅　 (74)专利代理 机构 武汉蓝宝石专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 42242 专利代理师 廉海涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测PML-RARα融合基因的荧光原位杂交探 针组及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种检测PML ‑RARα融合基因 的荧光原位杂交探针组及其制备方法和应用， 属 于基因检测技术领域。 本发明通过直接在PML和 RARα基因的目标区域构建与目标区域完全互补 的长度为45bp的单链片段作为候选探针， 然后将 候选探针进行BLAST比对得到说明书表1中所示 的1054个核苷酸序列， 再在每个核苷酸序列的两 端添加标签序列得到特征性引物并设计其扩增 引物， 经PCR扩增、 纯化后得到该探针组。 该探针 组用于检测PML ‑RARα融合基因的融合状态时， 具有敏感性高、 特异性强、 杂交背景干净、 信噪比 低的特点。 权利要求书1页 说明书18页 附图1页 CN 115141888 A 2022.10.04 CN 115141888 A 1.一种检测PML ‑RARα 融合基因的荧光原位杂交探针组， 其特征在于， 所述探针组由说 明书表1中所示的10 54个核苷酸序列制备 得到。 2.权利要求1所述的探针组的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 以PML和RARα 的核苷酸序列为依据， 筛选得到说明书表1中所示的1054个核苷酸序 列； S2、 在每个核苷酸序列的5'端添加序列为TAATACGACTCACTATAGGG的标签， 在3'端添加 序列为CCGCTGAGCA ATAACTAGCA的标签， 得到一系列带 标签的特 征性引物； S3、 合成所述特 征性引物并设计其PCR扩增引物对； S4、 以所述特 征性引物为模板进行PCR扩增， 对 扩增产物进行 纯化得到所述探针组。 3.根据权利 要求2所述的探针组的制备方法， 其特征在于， 步骤S1包括以下步骤： 以PML 和RARα 的核苷酸序列为依据， 在不含重复序列的区域分别设计含45个核苷酸序列， 设定探 针Tm为50℃， G ‑C含量范围为40～ 60％， 舍弃包含AAAA /TTTT/CCCC/GGGG的序列后， 得到1609 条候选探针， 再经过BLAST比对分析后， 得到如说明书表1所示的10 54个核苷酸序列。 4.根据权利要求2所述的探针组的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中所述PCR扩增引物 对的 正 向 引物的 序 列 为 ： T A A T A C G A C T C A C T A T A G G ， 反 向 引物的 序 列 为 TGCTAGTTATTGCTCAGCG G。 5.根据权利要求4所述的探针组的制备方法， 其特征在于， 步骤S3中PCR扩增的反应体 系如下： 10 ×buffer5 μL、 正 反向引物各(10 μM)2 μL、 带标签的模板1 μL、 10mM  dATP 1 μL、 10mM   dCTP 1μL、 10mM  dGTP 1μL、 10mM  dTTP 0.75μL、 1mM荧光染料标记 的dUTP2.5μL、 Taq  DNA  polymerase  0.5 μL、 ddH2O 35.25 μL； PCR扩增的程序为： 94℃5min、 55℃5min； 72℃2min、 94 ℃1min、 55℃1min， 30个循环； 72℃5mi n、 4℃保温。 6.根据权利要求5所述的探针组的制备方法， 其特征在于， 所述荧光染料为Alexafluor 系列荧光染料。 7.根据权利要求6所述的探针组的制备方法， 其特征在于， 所述Alexafluor系列 荧光染 料为Alexafluor5 55或Alexafluor  488。 8.一种试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1所述的探针组或包含如权利要求2～7任 一项所述的探针组的制备 方法制备的探针组。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含如下杂交缓冲液： 20ng/μLPML基因探针， 20ng/μLRARα基因探针， 45v/v％去离子甲酰胺， 10v/v％葡聚糖， 0.2mol/L柠檬酸钠缓冲液， 5 0mmol/LpH＝8.0～8.8的Tris ‑HCl缓冲液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141888 A 2检测PML‑RARα融合基因的荧光原位杂交探针组及其制备方 法 和应用 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及一种检测PML ‑RARα 融合基因的荧光原位 杂交探针组及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓细胞白血病(AML)的一种特殊类型(M3)， APL具有独特的临床表型及细胞形态学、 细胞遗传学和分子生物学特征。 约95％的APL患者 具有特异性染色体易位t(15； 17)(q22； q12)， 形成PML ‑RARα 融合基因， 其蛋白产物导致细胞 分化阻滞和凋亡不足， 是APL的主要发病机制。 APL易见于中青年人， 平均发病年龄44岁， APL 占同期AML的10％～15％， 发病率约为0.23/10万。 APL临床表现凶险， 起病及诱导治疗过程 中容易发生出血和 栓塞而引起死亡。 近三十年来， 由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的规范 化应用， APL已成为基本不用进行造血干细胞移植即可治愈的白血病。 [0003]荧光原位杂交技术(Fluorescence  in situ hybridization， 简称FISH)可以用于 评估PML ‑RARα融合基因的融合状态。 传统的商业化FISH探针主要使用BAC(Bacterial   Artificial  Chromosome)克隆作为探针经过荧光分子标记后进行杂交检测。 然而， BA C克隆 制备的探针存在一些非重复序列， 探针特异 性不高， 需要使用Cot1 ‑DNA进行非封闭性封闭， 且探针片段普遍偏大， 长度在20 0～500bp之间， 杂交效率偏低， 杂交时间长 。 发明内容 [0004]为了解决上述问题， 本 发明提供了一种检测PML ‑RARα 融合基因的荧光原位杂交探 针组， 该探针组由说明书表1中所示的1054个核苷 酸序列制备得到。 使用该探针组检测PML ‑ RARα 融合基因的融合状态时敏感性高、 特异性强且杂交背景干净， 信噪比低。 [0005]本发明制备 上述探针组的方法包括以下步骤： [0006]S1、 以PML和RARα 的核苷酸序列为依据， 筛选得到说明书表1中所示的1054个核苷 酸序列； [0007]S2、 在每个核苷酸序列的5'端添加序列为TAATACGACTCACTATAGGG的标签， 在3'端 添加序列为C CGCTGAGCA ATAACTAGCA的标签， 得到一系列带 标签的特 征性引物； [0008]S3、 合成所述特 征性引物并设计其PCR扩增引物对； [0009]S4、 以所述特征性引物为模板进行PCR扩增， 对扩增产物进行纯化得到所述探针 组。 [0010]在一些可选的实施方式中， 步骤S1包括以下步骤： 以PML和RARα 的核苷酸序列为依 据， 在不含重复序列的区域分别设计含45个核苷酸序列， 设定探针Tm为50℃， G ‑C含量范围 为40～60％， 舍 弃包含AAAA /TTTT/CCCC/GGGG的序列后， 得到1609条候选探针， 再经过BLAS T 比对分析后， 得到如说明书表1所示的10 54个核苷酸序列。 [0011]在一些可选的实施方式中， 步骤S3中所述PCR扩增引物对的正向引物的核苷酸序说　明　书 1/18 页 3 CN 115141888 A 3