(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210633549.9 (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 无锡市第九人民医院 地址 214000 江苏省无锡市梁 溪路999号 (72)发明人 王秋波　刘庆阳　程洋　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 江楠竹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感 染的方法 (57)摘要 本发明公开了利用疟原虫基因核酸序列探 针诊断疟疾感染的方法， 涉及基因工程技术领 域， 包括如下步骤： 外周血采集及DNA提取， 获取 疟原虫DNA的样本， 用分光光度计对所获得的疟 原虫DNA的样本进行纯度及浓度的鉴定， 并调整 DNA浓度为1ug/ml， 每份样本留取 10ul用于检测， 剩余样本存放与 ‑80度冰箱保存， PCR扩增反应； 待PCR反应结束后， 去2 5ul产物加入5u l电泳缓冲 染液充分混匀， 取所有30ul混合液加入5％琼脂 糖凝胶电泳孔内进行电泳， 电泳条件为30mA， 电 泳20分钟后， 取出凝胶， 在紫外线观察箱中观察 检测结果。 本发明设计并改良疟原虫GPI基因引 物序列， 相比于传统显微镜检方法减少疟疾感染 患者检测次数， 缩短检测时间， 提高疟疾感染检 测正确率。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114854889 A 2022.08.05 CN 114854889 A 1.利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟 疾感染的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤1： 外周血采集及DNA提取 患者随机时间肝素钠抗凝取血， 实验室内待确认血液样本无溶血无凝集， 经过重悬抗 凝血悬液、 离心机离心、 重悬洗涤、 NH4CI重悬、 试管离心， 得到细胞沉淀碎片， 洗涤、 离心后 上清为无色透明液体为止， 此沉淀即为含有疟原虫 虫体的细胞碎片沉淀； 步骤2： 获取疟原虫DNA的样本 所得虫体沉淀按照血 液基因组DNA提取按照试剂盒说明书来 提取疟原虫基因 组DNA； 步骤3： 用分光光度计对所获得的疟原虫DNA的样本进行纯度及浓度的鉴定， 并调整DNA 浓度为1ug/ml， 每 份样本留取10ul用于检测， 剩余样本存放与 ‑80度冰箱保存。 步骤4： PCR扩增反应 用常规PCR反应检测样本中疟原虫DNA， PCR反应体系中含有缓冲液， MgSO4，碱基混合物 过量， DNA聚合酶， 所用扩增模板为6分患者外周血样本提取的DNA片段， 扩增引物为本专利 设计引物配对， 用纯 水补齐至 50ul； 步骤5： 待PCR反应结束后， 去25ul产物加入5ul电泳缓冲染液充分混匀， 取所有30ul混 合液加入5％琼脂糖凝胶电泳孔内进行电泳， 电泳条件为30mA， 电泳20分钟后， 取出凝胶， 在 紫外线观察箱中观察检测结果。 2.如权利要求1所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， 步骤1的具体步骤为： 患者随机时间肝素钠抗凝取血5ml， 室温保存， 24小时内送至实验室。 实验室工作人员 接收样本时核实患者信息， 检查血液储存状态， 待确认血液样本无溶血无凝集， 用细胞等渗 液10ml重悬抗凝血悬液， 待血细胞呈混匀 状态后， 离心机离心， 离心后弃去上清， 细胞沉淀 再次用10 ml细胞等渗液重悬洗涤， 待细胞洗涤三次后， 弃去 上清细胞等渗液， 留细胞沉淀约 0.5ml， 然后加入0.17M  NH4CI重悬， 待细胞悬液混匀后， 放置于冰上静置10分钟后， 试管离 心， 此时上清为红色透明液体， 弃去 上清后， 沉淀为白灰色细胞沉淀， 即为细胞沉淀碎片， 之 后再用10 ml细胞等渗液洗涤3次， 至离心后上清为无色透明液体为止， 此沉淀即为含有疟原 虫虫体的细胞碎片沉淀 。 3.如权利要求2所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， 两次的离心条件均为3 000转每分钟， 离心10分钟。 4.如权利要求1所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， 步骤2的具体步骤为： 虫体沉淀加入1ml裂解液A， 用加样枪枪头来回抽吸沉淀， 至液体粘稠为止； 再在试管中 加入试剂B1ml， 充分混匀， 此时液体由粘稠变为清澈透明； 将所有 液体转移至离心柱C中， 离 心机离心， 离心后弃去收集管中的废液， 再离心柱中加入100ul试剂D， 再次离心， 弃去收集 管中的废液， 将离心柱 放置新的收集管中， 室温通风干燥 10分钟， 在离心柱中加入50ul洗脱 液E， 再次离心， 此时收集管中的液体即为含有疟原虫DNA的样本 。 5.如权利要求4所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， 三次的离心条件均为120 00转每分钟， 离心10分钟。 6.如权利要求1所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， 步骤4中的P CR反应条件按常规三部 分进行设置， 让P CR混合体系中的各种成分在热循环权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114854889 A 2体系中充分反应， 对目的DNA片段进行3 0个循环的扩增。 7.如权利要求1所述的利用疟原虫基因核酸序列探针诊断疟疾感染的方法， 其特征在 于， PCR引物序列如下： F： AAAGCTCATTATTATATATAT TTC R： AATATATCT TGTTTCTTCTTTTGCA。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114854889 A 3