(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210675849.3 (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 中国农业科 学院郑州果 树研究所 地址 450009 河南省郑州市管城回族区未 来路南端 (72)发明人 孙磊　刘崇怀　覃阳　樊秀彩　 张颖　姜建福　李民　 (74)专利代理 机构 北京动力号知识产权代理有 限公司 1 1775 专利代理师 梁艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与葡萄果实颜色相关的KAS P标记及其应用 (57)摘要 本申请提供了与葡萄果实颜色相关的KASP 标记KASP ‑g6及其检测引物组， 其位于葡萄基因 组Chr2染色体的15988491bp位置， 为T/C多态性； 其检测引物组核苷酸序列为SEQ  ID NO.1‑3。 本 申请还提供了该标记在预测葡萄果实颜色和葡 萄育种中的应用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114891918 A 2022.08.12 CN 114891918 A 1.一种与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP ‑g6， 其特征在于， 其位于葡萄基因组Chr2 染色体的1598 8491bp位置， 为T/ C多态性。 2.检测根据权利 要求1所述的与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP ‑g6的引物组， 其特 征在于， 所述引物组包括序列为SEQ  ID NO.2的上游分型引物， 序列为SEQ  ID NO.3的上游 分型引物， 序列为SEQ  ID NO.4下游引物。 3.检测葡萄果实颜色的试剂盒， 其特 征在于， 其包 含根据权利要求2所述的引物组。 4.根据权利要求2或3所述的引物组或者试剂盒在葡萄育种中的应用。 5.预测葡萄果实颜色的方法， 其中包括检测根据权利要求1所述的与葡萄果实颜色相 关的KASP标记KAS P‑g6的步骤。 6.根据权利要求5所述的方法， 其中所述方法中使用根据权利要求2或3所述的引物组 或者试剂盒进行PCR反应。 7.根据权利要求5所述的方法， 其中葡萄果实黄绿色单株表现为TT纯合， 葡萄红色系果 实单株表现为较浅的TC或色深的C C。 8.根据权利要求5所述的方法， 其中所述PCR反应体系为10.125ul： 2X  KASP master  mix， 5ul； 72X  primer mix， 0.125ul； DNA样品5ul。 9.根据权利要求5所述的方法， 其中所述PCR反应条件如下： 预变性95℃， 10min； 降落 PCR变性9 5℃， 20sec， 梯度退火温度61 ‑55℃， 60sec， 10个循环； 扩增PCR变性9 5℃， 20sec， 退 火温度55℃， 60sec， 35个循环； 荧光扫描25℃， 3 0sec。 10.根据权利要求5所述的方法， 其中所述PCR反应在96孔板上进行。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891918 A 2与葡萄果实颜色相关的KASP标记及其应用 技术领域 [0001]本申请属于分子生物学领域和农业育种领域。 具体地， 本申请提供了与葡萄果实 颜色相关的KAS P标记及其应用。 背景技术 [0002]葡萄属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis  L.)， 是世界上栽培最广泛和经济价值 最高的果树之一。 果实颜色是葡萄的重要经济性状， 主要由果皮花色苷含量和组分决定。 MYBA1和MYBA2两个转录因子对葡萄果 实花色苷的生物 合成具有重要的调控作用， 其突变很 好地解释了葡萄黄绿色果 实形成的机制。 但是， 对于红色系葡萄， 果实从粉红色到紫黑色变 异类型极为丰富， 呈现典型的数量性状特点。 对于红色系葡萄果 实颜色变化的分子机制， 目 前研究尚不清楚。 [0003]KASP技术是新一代高通量自动化S NP检测技术， 现已成为国际上S NP分型以及插入 缺失变异检测的主要 方法之一。 其基本程序是： 利用带有两种通用标签并连接SNP位点的两 条正向引物和一条反向引物构成Primer  mix。 带有不同荧光信号的两条检测引物Master   mix， 经三次PCR反应进行SNP位点荧光检测： PCR反应I： DNA模板变性， 与相符合的KASP引物 结合， 退火延伸后， 检测引物的序列被加上； P CR反应II： 合成等位基因特异性的末端序列的 互补链； PCR反应III： 特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长， 荧光信号产生 并被检测。 此时只需要一台实时荧光定量P CR仪即可对荧光信号的类别以及 含量进行检测。 同其他检测技术相比， KASP技术只需合成两个带有不同颜色的荧光基团和双链通用的探 针， 不需要针对每个SNP位点分别设计荧光探针， 具有高通量、 准确、 省时、 便捷、 低成本的特 点， 实现了更加灵活的检测， 已成功用于超过100多个物种的基因分型、 遗传 多样性分析、 指 纹图谱构建等方面。 发明内容 [0004]为了更深入地阐释红色系葡萄果实形成的分子机制， 我们前期已经以欧亚种 (V.vinifera) ‘红地球’ × ‘玫瑰香’杂交群体为材料， 对其果实颜色进行了系统评价， 基于 群体基因组重测序开发的SNP标记构建了高密度遗传图谱， 并进行了葡萄果实颜色QTL定 位。 [0005]图谱信息： 整合图谱中27454个SNP标记整合在1554个bin中， 分布在19个连锁群， 总遗传距离1442.638cM。 标记之间的平均遗传距离0.928cM。 每个连锁群的平均SNP和bin标 记数分别为1445和82。 连锁群的遗传距离最小的为34.051cM(LG3)， 最大的为107.001cM (LG18)， 单个连锁群的平均遗传距离为75.928cM。 遗传图谱最大的gap出现在LG17， 为 15.945cM。 19个连锁群g ap小于5cM的平均占比达9 9.928％， 其中8个连锁群占比达10 0％。 [0006]QTL位点信息： 2017、 2018和2019三年的果实颜色(CG)表型数据均定位到LG2上的 一个主效QTL位点命名为col ‑2， 此位点位于LG2上45.231 ‑48.955cM， LOD峰值位置位于 48.423cM处， LOD值 为17.55。说　明　书 1/5 页 3 CN 114891918 A 3