(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210654519.6 (22)申请日 2022.06.10 (66)本国优先权数据 202110651222.X 2021.0 6.10 CN (71)申请人 成都医学院第一附属医院 地址 610000 四川省成 都市新都区宝光大 道278号 (72)发明人 陈梅　许颖　张涛　杨雨晗　 吴东明　 (74)专利代理 机构 成都高远知识产权代理事务 所(普通合伙) 51222 专利代理师 张娟　郑勇力 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01)C12Q 1/682(2018.01) C12Q 1/6834(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 27/30(2006.01) G01N 27/327(2006.01) G01N 27/48(2006.01) (54)发明名称 一种三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记 材料和lncRNA分子的电化学传感检测方法 (57)摘要 本发明属于lncRNA 检测技术领域， 具体涉及 一种三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材料 和lncRNA分子的电化学传感检测方法。 利用该三 维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材料， 本发 明的lncRNA分子的电化学传感检测方法， 包括如 下步骤： 在上述复合纳米标记材料表 面修饰巯基 化的捕获探针； 将三维石墨烯/银纳米粒子/捕获 探针纳米标记材料与四种发夹型探针的溶液和 待检测溶液混合， 震荡孵育； 将得到的溶液离心 分离后即得纳米标记探针分子； 将纳米标记探针 分子负载到MEA上， 进行电化学测试， 根据电化学 响应检测lncRNA。 与现有的lncRNA检测方法相 比， 本发明在特异性分子识别、 选择性、 检测限、 精密度、 生物相容性和低毒性等方面更具优势， 在肺癌检测中具有很好的应用潜力。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 115466787 A 2022.12.13 CN 115466787 A 1.一种三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材料， 其特征在于： 它是将三维石墨烯和 银纳米粒子共同沉积到基底上制成。 2.按照权利要求1所述的纳米标记材料， 其特征在于： 所述银纳米粒子的粒径为20 ‑ 100nm， 和/或， 所述基底为 ITO。 3.权利要求1或2所述的纳米标记材 料的制备 方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)制备三维石墨烯， 并将三维石墨烯转移到基底上， 得到三维石墨烯修饰的基底； (2)利用化学还原法制备 银纳米粒子， 将银纳米粒子配制成电解质溶 液； (3)将步骤(1)中三维石 墨烯修饰的基底作 为电极在步骤(2)得到的电解质溶液中进行 电沉积， 即得三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材 料。 4.按照权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)制备三维石墨烯 的具体过程 为： (1.1)在金属泡沫N i表面生长石墨烯， 得到石墨烯包裹的金属泡沫N i； (1.2)将步骤(1.1)得到的石墨烯包裹的金属泡沫Ni浸入PMMA溶液后取出干燥， 得到 PMMA包裹的样品； (1.3)用氧化剂氧化 步骤(1.2)得到的样品中的金属泡沫N i， 得到去除N i的样品； (1.4)加热使步骤(1.3)得到的样品中的PM MA分解后， 即得三维石墨烯； 优选的， 步骤(1.1)的具体过程为将金属泡沫Ni放置于管式炉内， 在还原性气氛保护下 升温至900 ‑1100℃； 然后通入甲烷生长石墨烯； 进一步优选的生长石墨烯的时间为8 ‑ 12min； 优选的， 步骤(1.2)中石墨烯包裹的金属泡沫Ni浸入PMMA溶液的时间为2 ‑5s， 优选为 3s， 干燥的条件为120 ‑180℃下干燥8 ‑12min； 优选的， 步骤(1.3)中氧化剂为F eCl3； 优选的， 步骤(1.4)中PM MA分解的条件为在还原性气氛 下升温至40 0‑500℃保持1 ‑3h。 5.按照权利要求3或4所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中， 所述三维石墨烯在基 底上的担载量 为10‑20 μg/cm2。 6.按照权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(2)中制备银纳米粒子的具体过 程为： 向还原剂和保护剂的混合溶 液中缓慢均匀添加AgNO3溶液反应， 即得； 和/或， 所述电解质溶液为含有所述银纳米粒子的氢氧化钾和氢氧化锂水溶液， 其中银 纳米粒子浓度为1 ‑5mg/mL， 氢 氧化钾浓度为1 ‑50mg/mL。 氢 氧化锂浓度为1‑50mg/mL。 7.按照权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(3)中， 电沉积的条件为在4 ‑5V的 直流电源中沉积20 ‑40min。 8.一种lncRNA分子的电化学传感检测方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (a)在权利要求1或2所述的三维石墨烯/银纳米粒子复合纳米标记材料表面修饰巯基 化的捕获探针， 得到三维石墨烯/银纳米粒子 /捕获探针纳米标记材 料； (b)将步骤(a)得到的三维石墨烯/银纳米粒子/捕获探针纳米标记材料与 四种发夹型 探针的溶 液和待检测溶 液混合， 所述待检测溶 液优选为血清样品， 震荡孵 育， 捕获探针中包括序列0， 针对序列为1， 2， 3的lncRNA分子， 所述四种 发夹型探针的序列 为： 发夹型探针1： 0 ’， 1’， 2’， 3’， 4， 3， 2；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466787 A 2发夹型探针2： 4， 2， 3， 4 ’， 3’， 5； 发夹型探针3： 5 ’， 6， 5； 发夹型探针4： 5， 6 ’， 5’； (c)将经过步骤(b)处 理后的溶 液离心分离后即得纳米标记探针分子； (d)将步骤(c)得到的纳米标记探针分子负载到ITO电极上， 进以ITO为工作电极进行电 化学测试， 根据电化学响应 检测lncRNA。 9.按照权利要求8所述的检测方法， 其特征在于： 步骤(a)中， 将三维石墨烯/银纳米粒 子复合纳米标记材料修饰 ITO电极在开路电压下置于1 ‑10mg.ml‑1的BSA中孵育10 ‑20min,然 后取5‑15 μL的1‑5mg.ml‑1捕获探针滴在修饰电极表面室温下避光孵育1 ‑2h， 再冲洗去除非 特异性吸附。 10.按照权利要求8所述的检测方法， 其特征在于： 步骤(b)中， 所述发夹型探针的溶液 在90‑100℃下受热1 ‑3min后， 再与所述三维石墨烯/银纳米粒子/捕获探针纳米标记材料混 合； 和/或， 所述发夹型探针1具有如SEQ  ID NO.1所述的核苷酸序列， 所述发夹型探针2具 有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列， 所述发夹型探针3具有如SEQ  ID NO.3所述的核苷酸 序列， 所述发夹型探针4具有如SEQ  ID NO.4所述的核苷酸序列。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466787 A 3