ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2246—2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RT －PCR 检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020 - 03 - 03 发布 浙江省市场监督管理局 2020 - 04 - 03 实施 发 布 DB33/T 2246—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩 琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。 I DB33/T 2246—2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RT－PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）荧光定量RT－PCR检 测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪流行性乙型脑炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公 猪睾丸炎。 3 实验条件 3.1 仪器 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 高速冷冻离心机。 荧光定量 PCR 仪。 生物安全柜。 组织研磨仪。 微量移液器。 冰箱。 涡旋混匀器。 高压灭菌器。 3.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。 3.2.1 Trizol：核糖核酸（Ribonucleic acid, RNA）提取试剂。 3.2.2 氯仿：4 ℃预冷。 3.2.3 异丙醇：4 ℃预冷。 3.2.4 焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate ,DEPC）水：取 DEPC 100 μL，加超纯水至 100 mL，室 温过夜，121 ℃高压灭菌 15 min，分装，冻存备用。 3.2.5 75%乙醇：用 75 mL 无水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混匀，－20 ℃预冷。 1 DB33/T 2246—2020 3.2.6 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂：One Step Prime Script™ RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、Ex Taq HS（5 U/ µL）、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ和无 RNA 酶的水。 3.2.7 0.01mol/L PH7.4 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8g, 溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。 3.2.8 引物和探针，其序列如下：上游引物：5－GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5－ TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5－FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。 3.2.9 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2 株）。 4 操作步骤 4.1 样品采集 4.1.1 脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组织装入到无菌离心管 中并编号，冷藏送检或-20 ℃以下保存备用。 4.1.2 全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检。 若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20 ℃以下保存备用。 4.2 样品处理 4.2.1 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中，按 1：10 体积加入 PBS，置于组织研磨仪中充分研磨。 将研磨后的样品，反复冻融 3 次，10000 r/min 离心 5 min，取上清液至无菌离心管中，编号待检。 4.2.2 取全血 3500 r/min 离心 5 min，取血清至无菌离心管中，编号待检。 4.3 RNA 提取 4.3.1 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化的病毒 RNA 提取试剂盒。 4.3.2 取 n 个灭菌的 1.5mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进 行编号。 4.3.3 每管加入 750 μL Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 250ul,震荡数次，静置 5 min。再加入 200 μL 预冷的氯仿，震荡混匀，静置 5 min，于 4 °C 12 000 r/min 离心 15 min。 4.3.4 取与本标准 5.3.2 中相同数量的灭菌 1.5ml 离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准 5.3.3 中离心后的上清液（注意不吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积异丙醇，混匀，－20 °C 静置 30 min。 4.3.5 于 4 °C 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，缓缓加入 1 mL 75%乙醇，颠倒洗涤沉淀及管壁。 于 4 °C 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，室温条件下干燥后，加入 30 μ L DEPC 处理水，轻轻混 匀，溶解管壁上的 RNA，以 4 000 r/min 离心 10 s,冰上保存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行荧光 RT-PCR 扩增，若需长期保存，需置于-70 °C 冰箱保存。 4.4 荧光定量 RT－PCR 反应 4.4.1 反应体系组成 设立阳性对照、阴性对照，反应体系（20µL）由表1中物质组成。 2 DB33/T 2246—2020 表1 反应体系配制表 试剂 用量／µL 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 Ex Taq HS（5 U/µL） 0.4 PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 上游引物 （10 µmol/L） 0.4 下游引物 （10 µmol/L） 0.4 探 针 (10 µmol/L) 0.4 样品RNA 4 RNase Free dH2O 4 总 量 20 4.4.2 反应条件 反转录：42 ℃ 15 min；预变性： 94 ℃ 2 min；扩增：94 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，45个循环， 60 ℃时设置采集荧光。 4.4.3 荧光素的设定 Report Dye 设定为FAM，Quencher Dye设定为none。 5 结果判定 5.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩 增曲线的最高点为准。 5.2 质控标准 阳性对照的Ct值应≤30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值且无典型扩增曲线，二者同时成立 可判定试验成立，否则试验无效。 5.3 结果描述及判定 5.3.1 阴性判定 无Ct值，且无典型扩增曲线，判为阴性。 5.3.2 阳性判定 Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判为阳性。 5.3.3 可疑判定 Ct值＞35，且出现典型扩增曲线的样品，需重复检测；重复检测结果Ct值≤38且出现典型扩增曲线 的判为样品阳性，否则判为阴性。 3