ICS 65.120 B 25 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2550—2014 饲料中黄曲霉毒素B的测定 胶体金法 Determination of aflatoxin B, in feed-Colloid gold method 行业标准信息服务平台 2014-03-24发布 2014-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2550—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：李培武、姜俊、张奇、丁小霞、张文、张兆威、王督、唐晓倩。 行业标准信息服务平台 NY/T2550—2014 饲料中黄曲霉毒素B，的测定 胶体金法 1范围 本标准规定了胶体金法测定饲料中黄曲霉毒素B的方法。 本标准适用于饲料和饲料原料中黄曲霉毒素B测定。 本标准黄曲霉毒素B检出限为1. 0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样中黄曲霉毒素B在层析过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜 检测线上黄曲霉毒素BI-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色变浅，通过检测颜色变化进行测定。 4试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水，按照GB/T6682中的要求，二级。 4. 2蔗糖(C12H2Ou)。 4.3牛血清白蛋白(BSA)，纯度大于98%。 4.4吐温-20(Cs8H14O26)。 4. 5 甲醇(CH;OH)。 4.670%甲醇溶液：取70.0mL甲醇（4.5），加水（4.1)30.0mL，混匀。 4.7样品稀释液：取1.0g熊糖（4.2）、0.5g牛血清白蛋白（4.3）和2.5g吐温-20（4.4）溶解于 100.0mL水(4.1)中。 4.81000ng/mL黄曲霉毒素B标准溶液。 4.9100ng/mL黄曲霉毒素B标准储备液：准确吸取黄曲霉毒素B标准溶液（4.8)1.0mL于10mL 容量瓶中，甲醇定容。4℃可保存3个月。 警告： 由于黄曲霉毒素毒性很强，试验人员应注意自我保护。操作时，应避免吸入、接触黄曲霉毒素标准溶液。标准溶液 配置应在通风橱内进行，工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触黄曲霉毒素的容器，需浸人10%次氯酸 钠溶液12h以上。同时，为了降低接触黄曲霉毒素的机会，本标准鼓励直接购买并使用黄曲霉毒素的有证标准储备液。 5仪器设备 5.1光谱成像检测仪或胶体金免疫层析检测仪：图像分辨率优于2048×1532dpi。 5.2分析天平：感量0.1g。 5.3分样筛：20目。 5.4均质机，转速大于等于20000r/min。 1 NY/T 2550—2014 5.5漩涡混合器。 5.6恒温装置：（37.0±2.0)℃。 5.7微量移液器：1μL~10μL,10μL~100μL，100μL~1000μL。 5.8黄曲霉毒素B胶体金免疫层析装置（图1)：固定黄曲霉毒素B-BSA偶联物，检测灵敏度不低于 0.3ug/kg，用于样品中黄曲霉毒素及黄曲霉毒素Bi-BSA偶联物与胶体金标记抗体反应的载体。 6 (a)正视图 (b)侧视图 说明： 纸板； 5——样品垫； 一质控线； 2 一吸水垫； 6 检测垫； 7——检测线。 一金标垫； 图1黄曲霉毒素B，胶体金免疫层析装置 5.8.1黄曲霉毒素B,-BSA偶联率为(1：5)~(1：20)(BSA：AFB)。 5.8.2样品垫：玻璃纤维、聚酯纤维或纸质薄片。 5.8.3硝酸纤维素膜：4cm毛细时间不小于135s。 5.8.5 吸水纸。 5.8.6底板。 5.8.7连接胶带。 5.9中速定性滤纸。 5. 10 净化柱：3mL硅胶SPE柱。 6 分析步骤 6.1试样制备 样品粉碎至全部通过分样筛（5.3），充分混合。 2 NY/T2550—2014 6.2前处理和空白基质溶液制备 6.2.1前处理 准确称取25.0g试样置于烧杯中，准确加入100mL甲醇溶液（4.6），用均质机（5.4）在20000 r/min条件下提取2min，静置1min，中速定性滤纸（5.9）过滤，收集滤液，取2.0mL滤液过净化柱 （5.10)，收集净化液。用稀释液（4.7)稀释净化液至黄曲霉毒素B胶体金免疫层析装置（5.8)检测范围 内，漩涡混合器（5.5）混匀，备用。 6.2.2空白基质溶液制备：取阴性样品，按6.2.1制备空白基质溶液，备用。 6.3取100μL稀释后的净化液（6.2.1)加入于黄曲霉毒素B胶体金免疫层析装置（5.8)内，恒温装置 (5.6)中反应10min。 6.4上机(5.1)检测。 6.5标准曲线 分别准确吸取黄曲霉毒素B标准储备液（4.9)0.000mL、0.001mL、0.005mL、0.010mL、0.020 mL、0.050mL、0.100mL、0.150mL于10mL容量瓶中，用空白基质溶液（6.1.2）定容，分别相当于 0.00 ng/mL.0.01 ng/mL.0.05ng/mL.0.10ng/mL.0.20ng/mL.0.50ng/mL、1.00ng/mL、1.50ng/ mL浓度标准工作溶液。由低到高浓度进行（6.3、6.4)检测，根据检测线T信号值与质控线C信号值的 比值(T/C)和标准工作溶液浓度的对数值(logc)建立黄曲霉毒素B标准曲线。 7结果计算 7.1胶体金免疫层析装置有效确认 黄曲霉毒素B胶体金免疫层析装置质控线出现红色条带，视为胶体金免疫层析装置有效，可用目 测法或光谱成像检测仪或胶体金免疫层析检测仪（5.1)测定结果；如果胶体金免疫层析装置质控线不出 现红色条带、弥散或严重不均匀，视为胶体金免疫层析装置失效，需重新检测。 7.2目测法 黄曲霉毒素B胶体金免疫层析装置中检测线出现红色条带，表示样品中黄曲霉毒素B含量小于 其限量值，判定为阴性：黄曲霉毒素胶体金免疫层析装置中检测线未出现红色条带，表示样品中黄曲霉 毒素B含量大于其限量值，判定为阳性。 7.3仪器法结果计算与表示 试样中黄曲霉毒素B含量以质量分数X计，数值以微克每千克（μug/kg）表示，按式（1)计算。 ......(1) m 式中： β-—从标准曲线上查得的测定液中黄曲霉毒素BI含量的数值，单位为纳克每毫升(ng/mL)； 服务平台 V——样品测定液体积的数值，单位为毫升（mL）； n——试样稀释倍数的数值； m一试样质量的数值，单位为克（g）。 计算结果保留到小数点后一位。 8精密度 8.1重复性 采用仪器法测定，在重复性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0μug/kg时，两次独立测定结果 的相对相差不得超过20%；黄曲霉毒素B含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的相对相差不得 超过15%。 3 NY/T2550—2014 8.2再现性 采用仪器法测定，在再现性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果 的相对相差不得超过30%；黄曲霉毒素Bi含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的相对相差不得 超过20%。 行业标准信息服务平台 4 NY/T2550—2014 8.2再现性 采用仪器法测定，在再现性条件下，黄曲霉毒素B含量不大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果 的相对相差不得超过30%；黄曲霉毒素Bi含量大于10.0μg/kg时，两次独立测定结果的相对相差不得 超过20%。 行业标准信息服务平台 4