ICS 67.120 B 45 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3309—2018 肉类源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of animal-derived materials in meat- QualitativerealtimePCRmethod 行业标准信息服务平台 2018-12-19发布 2019-06-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3309—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东省食品药品检验研究院。 本标准主要起草人：步迅、张全芳、刘艳艳、范阳阳、霍胜楠、张卉、马德源、下如如、陈杰、杨雪、李燕、 杨连群。 行业标准信息服务平台 I NY/T3309—2018 肉类源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1范围 本标准规定了对羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性 成分进行鉴定的实时荧光PCR法。 本标准适用于生鲜肉、冷冻肉及肉制品中羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、 猪和大鼠9种动物源性成分的鉴 本方法检出限为1%。 2规范性引用文件 ARD 下列文件对于本 儿是 件。凡是不注日期的引 本（包括所有的修改单） 析实验室用水规格和武验方 GB/T 6682 肉方肉制品取样方达 GB/T969 GB/T 27 实验室 质量控制规范食品分子生物学检测 农业部240 公告 2016转基因动物及具产 06 TNA提 RCH 3术语和定义 义适 下列术语和 明 3. 1 C 实时荧光 PCR we realtimePCR 进程 在PCR反应 ENTER 未知模板进行定 性或定量分析。 3. 2 Ct值cyclethre 每个反应管内的荧光信号达到设定的耐值时所经历的循环数 4原理 根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物 工变区设计物种特异性探针，采 用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反 的光信号及循环阈值，判定羊（绵羊、山 羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性成分 5试剂或材料 除另有规定外，仅使用分析纯试剂。 5.1水:GB/T6682，一级。 5.2生理盐水：称取0.85gNaCl加20mL水溶解，然后加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃） 条件下灭菌20min。 5.31mol/LTris-HCl(pH6.4)溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用浓HCl 调节pH至6.4，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 1 NY/T3309—2018 5.410mol/LNaOH溶液：称取80gNaOH溶解于160mL水中，冷却至室温，再加水定容至200mL。 5.50.5mol/LEDTA-Naz（pH8.0）溶液：称取18.6gEDTA-Na2溶解于70mL水中，用10%的 NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保 存待用。 5.610%十二烷基磺酸钠（SDS)溶液：称取10gSDS溶解于80mL灭菌水中，加热至完全溶解后，冷 却至室温，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.75mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl溶解于80mL无菌水中，加水定容至100mL，103.4kPa 蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.8细胞裂解液(LysisBuffer):取1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液20mL,0.5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液5mL，5.0mol/LNaCl溶液10mL10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL，混匀。 5.920mg/mL蛋白酶K溶液：称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL，分装后于 一20℃保存。 5.10RNA酶溶液：将1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100℃加热15min，缓慢冷却至 室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。 5.11氯仿+异戊醇混合液：将氯仿和异戊醇按照24十1的体积比例配制。 5.1270%乙醇：量取70mL无水乙醇，加人30mL水。 5. 13TE缓冲液:将 0.5mL的10 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)溶液、0. 1mL的 0. 5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液加人到50mL容量瓶中，调pH8.0,加水定容，103.4kPa蒸汽压（121℃)灭菌20min，降至室 温，4℃保存备用。 5.14羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物源性实时荧光PCR 检测试剂盒试剂：2XTaqManMasterMix，含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20μL）、Mg+（终浓度 2.0mmol/μL）、dNTPs（终浓度0.2mmol/μL）。羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水 貂、猪和大鼠9种动物源性基因组DNA阳性标准品。 6仪器设备 6.1实时荧光定量PCR仪：4通道以上。 6.2紫外分光光度计：波长190nm~900nm 6.3分析天平：感量0.1mg。 6.5水浴锅。 6.6高压灭菌锅。 6.7冰箱：-20℃~4℃。 6.8微量移液器：100μL1000μ，10μL~200μL,2μL~20L0.5μL~10μL 7检测用引物和探针 内参引物探针序列及羊（绵羊、山羊）、狐狸、鸡、牛（普通牛、黄牛）、马、鸭、水貂、猪和大鼠9种动物 的通用引物和特异性探针序列见附录A中的表A.1。引物探针在序列中的位置参见附录B。 8试验步骤 8.1取样 对鲜肉、冻肉及肉制品的取样方法按GB/T9695.19的规定执行。 2 NY/T3309—2018 8.2试样制备 8.2.1整块肉，取3g肉块，用生理盐水（5.2)清洗，在液氮中研磨成粉末。 8.2.2碎肉、肉片或肉卷等冷冻混合肉，混匀后，称取10g样品，用生理盐水（5.2)清洗，在液氮中研磨 成粉末。 8.3DNA提取 DNA提取及纯化方法按农业部2406号公告—7—2016的规定执行。 8.4实时荧光PCR反应 8.4.1试样实时荧光PCR检测 8.4.1.1多重实时荧光PCR：分 AB.C3组PCR反应体系进行多重实时荧光PCR。A组包括羊（绵 每组PCR反应体系中包含3种动 物源性的特异探针，并加人内参 8.4.1.2单重实时荧光PCR.9种动物单重 8.4.2对照实时荧光PCR反应体系 在试样PCR反应的同时一设置 对照、空白对照 RES a）阴性对照：以9种双物之外的动物 DNA b）空白对照： 以水作为空自对照 阳性对 将羊（绵） 山羊广狐狸鸡 ) 大鼠 9种动物基因 组DNA 等量混习作为阳性对照 注：每个POR 立设费3次平行室 8.4.3实时荧光PR反 分别按照 1.2表A.3、表A4和表A.5依次加人试剂，配制PCR反应 表 PCR反应管中 人模板 DNA:3000F 离心士mins 汉出PCR 义中 8.4.4实时荧光PCR反应程序 min.95变性1060c退火延伸35 95℃预变生 文集荧光食 31 9试验数据处理 9.1对照检测结果 空白对照、阴性 和限性 贸全部满足下送 a）空白对照：A.B.( D4红POX 系对应的反应孔均无FAM IOE.C 和CY5荧光的典型扩 增曲线； 阴性对照：A、B、C、D4 组PCR体系 b) 寸应的发应孔均无FAM、JOE、CY3荧光的典型扩增曲 线；而CY5有典型扩增曲线， ，月Ct值≤35.0； 阳性对照：A、B、C、D4组PCR体系对应的反 c) 型扩增曲线，且Ct值≤35.0。 9.2样品检测结果分析和表述 9.2.1在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增曲线(Ct值<35.0)的情况下，当有FAM、JOE、 CY3荧光典型扩增曲线出现，若Ct值<35.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分：若无典型扩增曲 线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。 9.2.2在PCR反应体系有效且内参基因出现典型扩增曲线（Ct值<35.0)的情况下，当有FAM、JOE、 CY3荧光扩增曲线出现，但35.0<Ct值<40.0，则需要重新提取DNA加大模板量进行PCR反应。若 再次扩增后的Ct值<40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则 判定样品中未检出相应的动物源性成分。 3 NY/T 3309—2018 9.2.3对各种样品检测结果的判定，见表A.6。 10检测过程中防止交叉污染的措施 按GB/T27403的规定执行。 行业标准信息服务平台 NY/T 3309—2018 附 录A （规范性附录） 实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定 A. 1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 见表A.1。 表A.1 实时荧光定性PCR引物/探针序列 扩增片段 引物探针名称 缩写 序列（5°-3） bp 通用引物上游 UNF AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA 228~241 通用引物下游 UNR GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 内参引物上游