ICS 67.120.30 X 20 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 3049—2015 刺参及其制品中海参多糖的测定 高效液相色谱法 Determination of sea cucumber polysaccharides in Apostichopus japonicus and interrelatedproducts- 行业标准信息服务平台 High performance liquid chromatography 2015-02-09发布 2015-05-01实施 中华人民共和国农业部 发布 SC/T3049—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部渔业渔政管理局提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会（SAC/TC156/SC3）归口。 本标准起草单位：中国海洋大学、大连子岛渔业集团股份有限公司、山东东方海洋科技股份有限 公司、中国水产科学院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：薛长湖、薛勇、刘小芳、常耀光、黄万成、刘云涛、王联珠。 行业标准信息服务平台 I SC/T 3049—2015 刺参及其制品中海参多糖的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了刺参（Apostichopusjaponicus）及以刺参为原料加工而成的干刺参、即食刺参、胶囊、 浆液等深加工品中海参多糖含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于刺参（Apostichopusjaponicus）及以刺参为原料加工而成的干刺参、即食刺参、胶囊、 浆液等深加工品中海参多糖含量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T3016水产品抽样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 海参多糖 sea cucumberpolysaccharides 由海参岩藻聚糖硫酸酯和海参硫酸软骨素组成。海参岩藻聚糖硫酸酯是一类由L-岩藻糖聚合形 成的直链硫酸化多糖；海参硫酸软骨素是一类具有岩藻糖支链取代的硫酸化多糖，主要由D-乙酰氨基 半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-岩藻糖构成。 4原理 样品经酶解、乙酸钾沉淀、酸解后制备得到海参硫酸软骨素水解液，水解液中岩藻糖与1-苯基-3- 甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生反应，XDB-C1：色谱柱分离，经配有紫外检测器的高效液相色谱仪测 5试剂 信息服务平台 除另有说明外，所用试剂均为分析纯试剂。 5.1试验用水应符合GB/T6682一级水的要求。 5.2标准物质：L-岩藻糖（Fuc），纯度≥99%。 5.3内标物：乳糖（Lac)，纯度≥99%。 5.4甲醇：色谱纯。 5.5乙腈：色谱纯。 5.6三氯甲烷。 5.7冰乙酸。 5.8盐酸。 5.9三氟乙酸。 5.10木瓜蛋白酶：食品级。 SC/T 3049—2015 5.11乙酸钠。 5.12乙二胺四乙酸。 5.13半胱氨酸盐酸盐。 5.14乙酸钾。 5.15氢氧化钠。 5.16磷酸二氢钾。 5.171-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。 5.18 30.1mol/L乙酸钠缓冲液：准确称取8.20g无水乙酸钠，用水溶解并定容至1000mL，用冰乙酸 调节 pH至 5.9~6. 1。 5.194mol/L三氟乙酸溶液：准确移取30mL三氟乙酸，用水稀释至100mL。 5.200.3mol/L氢氧化钠溶液：准确称取1.20g氢氧化钠，用水溶解并稀释至100mL。 5.210.3mol/L盐酸溶液：准确移取2.5mL盐酸，用水稀释至100mL。 5.220.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液：准确称取174mg重结晶的1-苯基-3-甲基 5-吡唑啉酮，用2mL甲醇溶解。 5.23岩藻糖标准储备液：准确称取经真空干燥至恒重的L-岩藻糖（5.2）164mg，用水溶解并稀释至 100mL。该溶液浓度为10mmol/L，4℃密封避光存放，有效期15d。 5.24岩藻糖标准工作液：准确移取适量岩藻糖标准储备液（5.23），用水稀释成浓度为0.10mmol/L、 0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L、1.00mmol/L、1.25mmol/L的岩藻糖系列标准工作液，当 天配制。 5.25内标工作液：准确称取经真空干燥至恒重的乳糖（5.3)68mg，用水溶解并稀释至100mL。该溶 液浓度为2mmol/L，4℃密封避光存放，有效期15d。 5.260.05mol/L磷酸盐缓冲液：准确称取6.80g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释至1000mL，用0.3 mol/L氢氧化钠溶液（5.20)调节pH至6.8~7.0。使用前，用0.45μm微孔滤膜过滤。 5.27磷酸盐一乙腈溶液1：取乙腈150mL，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（5.26）稀释至1000mL。 5.28磷酸盐一乙腈溶液2：取乙腈400mL，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（5.26)稀释至1000mL。 6仪器和设备 6. 1 6.2天平：感量0.01g。 6.3分析天平：感量0.0001g。 6.4离心机：15000r/min。 6.5电热恒温鼓风干燥箱。 6.6超声波清洗仪。 6.7涡旋混合器。 6.8恒温水浴锅。 6.9恒温水浴振荡器。 6.10氮吹仪。 6.11 pH计。 6.12微量移液器及配套枪头。 6.13小型粉碎机。 2 SC/T 3049—2015 7测定方法 7.1试样制备 鲜刺参去肠腺、灰嘴，剪成0.5cm×0.5cm的小块，70℃烘干12h，粉碎，过10目筛，混勾备用；干 刺参，粉碎，过10目筛，混匀备用；即食刺参，剪成0.5cm×0.5cm的小块，70℃烘干12h，粉碎，过10 目筛，混匀备用；胶囊，取内容物混匀备用；浆液，混匀备用。 7.2试样海参硫酸软骨素的提取与水解液的制备 7.2.1鲜刺参、干刺参、即食刺参及刺参胶囊等固体制品 准确称取（1.00±0.05）g试样，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/L乙酸钠缓冲液 （5.18），加入100mg木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸盐酸盐，涡旋混合，60℃恒温 液转移至50mL烧杯中，加人6.13g乙酸钾，涡旋混合，超声至乙酸钾完全溶解，于4℃静置12h后转 移至另一50mL离心管，于9000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用5mL水超声溶解后转移至10 mL容量瓶，用水稀释至刻度，即得海参硫酸软骨素溶液。取1mL海参硫酸软骨素溶液于5mL安培瓶 中，加人1mL4mol/L三氟乙酸溶液（5.19），充氮封管，110℃水解8h后，于70℃氮气吹干，加2mL水 超声溶解残余物，用0.3mol/L氢氧化钠溶液（5.20）调节水解液pH至6.57.5后转移入5mL容量 瓶，用水稀释至刻度，即得海参硫酸软骨素水解液。 7.2.2刺参原浆液、刺参口服液、刺参酒、刺参乳饮料等液体制品 准确移取25mL试样，置于100mL烧杯中，加入25mL0.1mol/L乙酸钠缓冲液（5.18），加入 100mg木瓜蛋白酶、73mg乙二胺四乙酸和44mg半胱氨酸盐酸盐，涡旋混合，60℃恒温水浴振荡酶解 24h，将酶解液转移至50mL离心管中，于9000r/min离心10min。弃去沉淀，上清液经0.45μm水膜 过滤后转移至100mL烧杯中，加人12.27g乙酸钾，涡旋混合，超声至乙酸钾完全溶解。 7.3试样衍生及净化 0.3mol/L氢氧化钠溶液（5.20），涡旋混合，70℃水浴反应30min，取出冷却至室温，加450μL 0.3mol/L盐酸溶液（5.21），涡旋混合，加1mL三氯甲烷，充分振荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层， 按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次。将上层水相过0.45um滤膜，供高效液相色谱分析。 7.4岩藻糖系列标准工作溶液衍生 分别准确移取浓度为0.10mmol/L、0.25mmol/L、0.50mmol/L、0.75mmol/L、1.00mmol/L、 1.25mmol/L的岩藻糖标准工作液（5.24）400L于6个10mL具塞试管中，分别加人50uL2mmol/L 氢氧化钠溶液（5.20），涡旋混合均匀后，制备岩藻糖系列标准溶液衍生物。以岩藻糖衍生物的峰面积与 乳糖衍生物的峰面积之比为纵坐标，以相应的岩藻糖浓度为横坐标绘制标准工作曲线。 7.5测定 7.5.1色谱参考条件 7.5.1.1色谱柱：XDB-C8，5μm，250mmX4.6mm(内径）或性能相当者。 7.5.1.2柱温：25℃。 7.5.1.3检测波长：254nm。 7.5.1.4进样量：20μL。 7.5.1.5流速：1.0mL/min。 7.5.1.6流动相：A：磷酸盐一乙腈溶液1（5.27)，B磷酸盐一乙腈溶液2（5.28)；梯度洗脱程序 3 SC/T 3049—2015 见表1。 表1流动相梯度洗脱程序 时间，min A,% B,% 0 100 0 10 92 8 40 63 37 45 100 0 7.5.2色谱分析 分别注入20uL岩藻糖系列标准衍生液（7.4）和试样衍生液（7.3）于高效液相色谱仪中，按7.5.1 规定的色谱条件进行分析，记录峰面积，试样液中岩藻糖衍生物的响应值均应在标准曲线范围之内。根 据标准品的保留时间定性，内标法定量。岩藻糖标准溶液衍生物和试样液衍生物液相色谱图参见 附录 A。 7.6结果计算和表述 试样中海参